凯时国际网址治疗疾病的细胞工程:在哺乳动物细胞中设计、构建程序化基因线路

  新闻资讯     |      2022-08-08 04:18

  凯时国际手机版官网登录应Protein & Cell杂志编辑部的邀请,来自苏黎世联邦理工大学的合成生物学大师、世界著名哺乳动物合成生物学鼻祖院士撰写的题为Therapeutic cell engineering: designing programmable synthetic genetic circuits in mammalian cells的综述论文于近日在线发表,该综述全面总结了利用哺乳动物细胞基因线路设计的细胞治疗方法正在从概念验证走向临床应用。为方便广大读者更直观的了解全文的内容,BioArt特别组织了华东师范大学生命科学学院叶海峰教授(Martin Fussenegger院士的博后)团队对该综述进行了全文编译,以飨读者!

  利用哺乳动物工程化细胞在患者体内按需生产治疗药物的细胞治疗方法正在从概念验证走向临床应用。凯时国际网址人工定制的治疗性细胞可以感应、处理疾病相关信号,并以可编程和可预测的方式做出响应。凯时国际网址该综述先介绍治疗性细胞的设计策略和可用的工具。接着,讨论包括开环式基因线路和闭环式基因线路在内的多种调控细胞行为的基因线路设计策略。同时,本文着重强调定制细胞在多种疾病包括临床和实验疾病模型中的早期诊断和治疗的应用。最后,本文展望如电子装置等新型科技及其融入未来细胞治疗的潜在可能。

  健康和保健计划强调疾病的预防、早期诊断以及有效治疗方法的选择。疾病的早期发现可以提高治疗效率,改善患者生活质量,同时减少患者和卫生保健系统的经济成本。然而,由于缺乏早期诊断,目前临床干预手段往往在疾病晚期才开始介入。大多数情况下,只有出现一定病症后,病人才会咨询医生,这导致了医生只能“对症下药”,而不能预防疾病的发生。此外,处方药物的使用通常需要遵循一定的规则,包括严格的进药时间间隔,以及药物用量需要根据患者体重、年龄和性别来决定,然而这些规则不一定适合每位患者实际的身体状况。因此,与传统的“一粒药就能解决所有问题”的方法不同,下一代药物亟需符合个性化的治疗策略,既能自主、早期检测,又能根据疾病的不同阶段实时提供适当剂量的治疗药物。

  治疗诊断学(Theranostics)结合治疗学和诊断学,采用了可以自主检测病人疾病状态的植入系统,为潜在的疾病提供正确的治疗。现有两种类型的诊疗系统,分别为电子系统和生物系统。两者都配备了灵敏的传感器,能够感知与疾病相关的生物标志物水平,并将其转化为数字或生物输出。人工胰腺是电子诊疗设备的基准,它可以检测糖尿病患者血液中葡萄糖水平,并通过集成胰岛素泵自动向患者体内注射合适量的胰岛素。与传统打针的治疗方式相比,这类电子设备极大地提高了患者的生活质量,但其设备的复杂性,使用过程中给患者社会生活带来的不便性,以及必须定期补充治疗药物等局限性阻碍了它们进一步临床应用。相比之下,生物的诊疗系统是基于植入的工程细胞,这些细胞可以通过感知外界信号做出相应的治疗响应。另外,机体在提供足够营养和能量的情况下,这类基于生物系统的定制细胞可获得很长的“寿命”。

  合成生物学是利用工程学的设计理念,将标准化模块进行合理组装,创造出具有特定功能的系统或新的生命个体。合成生物学通过合成基因工程化的细胞,又称之为定制细胞,开发了一系列可编程、可预测的细胞治疗策略。定制细胞可以感知用户定义的输入信号并对其进行处理,然后用可定制化的治疗输出物质做出合适的响应。通常,有三种类型的定制哺乳动物细胞用于疾病治疗:组织驻留细胞、干细胞和人工细胞。自然形成的细胞具有特定的生物学功能,在这些细胞里添加新合成的基因环路,可以通过增强它们的活性、特异性或效率等来改善细胞功能。例如,免疫细胞经过改造后可以表达合成受体,从而对抗它之前无法有效处理的疾病。相对于这些细胞来说,人工细胞是经过工程化改造的细胞,它不是天然就能在设定的领域中发挥功能,而是装备了新功能的可塑性细胞。人类胚胎肾细胞就属于这类细胞,它可以在被改造后感应体内高水平的血糖,并产生胰岛素,来模拟β细胞的功能。工程化的干细胞组成了第三类定制细胞,它们可以通过直接产生治疗分子或促进其他治疗细胞的再生来推动临床治疗。例如,定制间充质干细胞具有固有的癌细胞趋向性,可利用它们将治疗药物递送至肿瘤微环境中。另外,定制干细胞中的合成谱系控制网络能促使干细胞以经济有效、强健可靠的方式分化为有治疗功能的细胞 (如β细胞)。

  综述首先介绍用于细胞工程的合成生物学工具箱,其次详细论述自给自足的工程细胞,它们可以自主地 (闭环) 或通过特定化合物或物理因素诱导下 (开环) 以可控的方式调控治疗药物的生产。最后,综述讨论了新兴技术以及它们在下一代细胞治疗中的应用。

  哺乳动物的细胞工程通常从设计、构建具有特定功能的基因线路开始,然后将其上载至相应的原代细胞、永生细胞系或干细胞中 (图1B)。定制细胞具有无限增殖的特征,通常只用于概念证明研究。一旦移植后,这些细胞难免会受宿主免疫系统的攻击。自体的原代细胞保留了许多自身的功能,以及患者来源的干细胞可以在不触发免疫反应的情况下进行移植,对转化医学都非常有吸引力,但它们都存在寿命有限的问题。与定向分化细胞和干细胞相比,治疗性人工细胞易于处理,更适合扩大培养。遗传物质通常通过化学试剂 (如脂质体等阳离子试剂)、物理试剂 (如电穿孔) 或生物试剂(例如,病毒) 递送到哺乳动物细胞内。基因组分可以从外源质粒中瞬时表达,也可以整合到工程细胞的基因组中,以确保稳定表达。如今,基因编辑技术的出现如CRISPR/Cas9系统能够高特异性和准确性地将基因线路整合到宿主基因组某个特定位点上。

  为了在哺乳动物细胞中设计遗传电路,必须考虑三个问题:细胞会接收到什么刺激?如何处理刺激信号?如何做出反应?(图1C)。诱导剂通常是与疾病相关的生物标记物、化学分子或其他可远程控制的信号,这些将在下面的章节中做详细讨论。为了能检测到这些刺激信号,细胞需要配备一个合适的传感器系统。传感器是一类能够检测和响应目标配体的生物分子,具有较高的配体特异性和灵敏性。传感器利用自身与配体之间的相互作用导致自身结构的构象变化,最终使输入信号从环境中通过质膜进入细胞质或细胞核。质膜受体和胞质受体是合成生物学最常用的传感器,其中包括天然受体和嵌合受体两大类型。天然受体自带特定功能可被用来构建具有类似功能的工程细胞,例如视黑素是一种对蓝光敏感的G蛋白偶联受体(GPCR),它存在于动物眼睛中用于调节睡眠 (Mure et al., 2016),当视黑素蛋白在非视网膜细胞中(例如HEK细胞)表达后可以作为感知光的受体。嵌合受体是人工合成受体,由不同蛋白质的结构域拼接组成,可以为没有已知天然受体的配体作为新受体,或替代原始信号通路中的受体。凯时国际网址例如GEMS(通用细胞外分子传感器)平台,通过在天然的受体(EPOR)上添加新的配体结合域(如单链抗体)来特异性地识别靶向配体。同时,该人工受体的激活可以通过替换细胞内信号转导域而激活各种信号通路。与质膜受体类似,可转换蛋白受体(胞质受体),可在与其配体相互作用时进行激活/失活。

  激活状态的传感器可以触发内源性信号通路或正交系统途径。换句话说,受刺激的细胞可以激活内源性或正交途径来处理输入信号,并输出适当的反应信号。质膜受体(天然受体、嵌合受体和离子通道)通常会激活内源性信号通路,引发细胞内第二信使的增加,从而导致转录因子的激活或细胞代谢的变化。相比之下,正交系统旨在最大限度下减少激活成分和内源性信号通路之间的串扰。这些系统通常依赖于来自于其他生物的蛋白质结构域,例如,合成的正交系统通常用于控制哺乳动物细胞中的基因表达,该系统利用来自细菌或酵母的DNA结合蛋白 (如TetR或Gal4) 与病毒转录激活因子 (如VPR, VP16, VP64) 的融合。与内源性信号通路通过信号转导级联反应(如MAPK通路)促进信号放大不同,正交系统通常是线性工作的,没有放大。因此,当内源性信号通路的完整性对特定功能至关重要,或与内源性信号通路的串扰会导致不良副作用时,就需要正交系统的构建。

  疾病的治疗需要通过植入细胞来进行治疗,根据目标疾病的性质设计反应计量,通过使用不同的生产和分泌过程可以实现不同的治疗反应。定制细胞通过从各自的基因组位点或合成表达单元转录表达所需 (反式) 基因,实现治疗药物释放、细胞分化或细胞迁移等。基于转录的治疗反应通常很慢(刺激后4-8小时),这种延长的动力学适用于治疗需要持久、长期变化的疾病 (例如,在免疫细胞上表达工程化受体以对抗癌症)。相比之下,对于需要在几分钟或几小时内给予治疗性药物的疾病(例如Ⅰ型糖尿病),快速响应至关重要。对此,可以提前在细胞内部生产和储存治疗性蛋白,在受到刺激时立即释放,无需等待转录和翻译过程。在这种方法中,转录和翻译是在非诱导状态下完成的,细胞刺激只触发治疗药物的运输和分泌。治疗性蛋白质可以被储存起来并从任何一个合成的囊泡或天然的细胞器中释放 (例如内质网或高尔基体) 。

  图1. 治疗性细胞工程。(A) 哺乳动物细胞可以被设计成接收使用者定义的输出,处理,并以可编程、可控和可预测的方式作出反应。(B) 基于合成生物学细胞疗法的细胞类型及其特性。(C) 设计一个治疗性细胞的主要步骤,包括传感器模块、处理平台和响应平台的设计。传感器模块由各种诱导剂(与疾病相关的生物标志物、化学分子和物理信号)和一系列可被诱导剂刺激的受体(天然受体、嵌合受体、离子通道和可转换蛋白受体)组成。定制细胞通过内源性信号通路(如此处描述的钙通路)或正交通路处理输入信号,以产生生物反应。响应平台可以设计为慢反应(如所需基因的转录)或快反应(如预形成的治疗蛋白的快速释放)。

  细胞工程的分子工具通常用于控制治疗分子的活性或剂量。目前基于闭环和开环电路的两种类型控制系统都能提供精准的实时控制。在闭环系统中,疾病生物标志物触发细胞中的分子反馈线路,表达治疗性蛋白质,进而使生物标志物的浓度下降,治疗性蛋白质的表达也随之逐渐下降。根据生物标志物是可溶的还是固定在质膜上,闭环系统可以分为两种。膜结合的生物标记物通常呈现在细胞表面(例如被病毒感染的细胞或癌细胞)(图2A),在这种情况下,配体结合和细胞的激活需要细胞间的物理接触,众所周知的例子如在膜上表达嵌合抗原受体的工程T细胞 (CAR)。带有靶向细胞表面标志物 CD19 的 CAR- T 细胞已获得 FDA 批准,目前用于治疗不同类型的白血病(例如Kymirah from Novartis) 。CAR是一种由融合在跨膜结构域的单链可变片段(生物标记)和胞内的T细胞激活信号域组成的嵌合受体。用 CAR 改造 T 细胞是 T 细胞工程中的一个热门领域,不同的策略已被用于提高改造细胞的功效,包括交换或扩大细胞内信号域和定制诱导后激活的基因 (BiTE和TRUCK),还能够通过定制输入和输出信号来提高 CAR 的特异性。例如,拆分、通用和可编程 (SUPRA) 的 CARs的设计使单个T细胞能够与用户定义的不同的抗原结合,这允许通用设计性T细胞根据选定的抗原来调节反应的强度。为了做到这一点,在SUPRA系统中,CAR的细胞外结构域与其余部分分离,两者 (细胞外和其余部分) 分别与一个亮氨酸拉链融合。跨膜信号融合域与胞外亮氨酸拉链的表达产生了一种通用型的受体CAR-T细胞,这个受体细胞可以通过添加不同的scFV-亮氨酸拉链融合来补充,形成一个功能性的CAR。另一种增加CAR-T细胞特异性的方法是增加可同时识别的生物标记的数量。这种策略更为安全,并且允许CAR-T细胞只有当所有的特异性的生物标记物在一个靶细胞上(AND门 CAR T细胞)或者只有一组特定的生物标记存在而另一组不存在时才能被激活(A AND NOT B)。与CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的成功相比,诸如T细胞对实体肿瘤的穿透性差、抑制性肿瘤微环境 (TME) 和潜在的副作用等问题都阻碍了CAR-T细胞治疗在实体肿瘤中的应用。因此,用 CAR 修饰其他类型的细胞作为克服其中一些障碍的方法引起了极大的兴趣。例如,用 CARs (CAR-M) 转导的巨噬细胞可以有效地促进抗肿瘤反应和实体瘤的根除。其他工作则利用了集成传感和激活蛋白 (iSNAP),它允许巨噬细胞忽略肿瘤细胞用来逃避免疫系统反应的自卫信号机制。具体来说,iSNAP表达的巨噬细胞将肿瘤细胞的逃逸信号识别为吞噬信号。用 CAR (CAR-NK) 改造的自然杀伤 (NK) 细胞显示出比 T 细胞疗法更少的副作用。虽然CAR受体只在免疫细胞中起作用,细胞与细胞的接触也可以在其他细胞类型中被调节(图2B)。例如,合成Notch (synNotch)受体是一种嵌合的单通道跨膜受体,具有定制的靶向特定的抗原 (生物标志物) 的细胞外结合域,并与跨膜和细胞内信号域融合(Morsut et al., 2016)。与 CAR 受体相反, synNotch 受体可触发正交途径来激活所需基因的表达。在这种情况下,T 细胞与其靶标之间的物理相互作用产生的机械力暴露了 synNotch 受体跨膜部分中隐藏的蛋白酶位点,该位点随后可以被蛋白酶切割,释放转录激活剂,该激活剂易位至细胞核并启动所需基因的转录。该系统已经使用工程化非免疫细胞成功应用胚胎发育过程中的模式形成。针对乙肝病毒抗原的synNotch受体的非免疫生物传感器细胞也可以对病毒样颗粒产生抗病毒蛋白。此外,synNotch 受体的表达已被用于增加或改变 CAR-T 细胞的特异性,通过在识别癌细胞上的其他抗原时靶向表达 CAR 受体或通过分泌免疫介质刺激肿瘤部位的免疫系统。为了扩大 CAR 和 synNotch 的靶向能力,已经开发出一种称为 SNAP 的通用可切换策略,用于将工程化 T 细胞重新靶向多种抗原。在 SNAP-CAR/-synNotch 系统中,SNAP 标签自标记酶在 T 细胞膜上的表达使受体与共同施用的苄基鸟嘌呤 (BG) 偶联抗体之间发生共价相互作用。然后,针对不同抗原的抗体可以激活 SNAP 受体及其下游效应器功能。

  另一种基于非免疫细胞中膜锚定的生物标志物的策略是,在HEK和MSC细胞中,嵌合的IL4/13受体与信号猝灭磷酸酶(CD43ex-45int)共同表达。嵌合的IL4/13受体触发了一个JAK-STAT通路,在缺乏膜结合配体的情况下,CD43ex-45int的抑制作用阻碍了该通路。JAK-STAT 信号通路可以通过具有STAT结合位点的表达元件重新被表达目的基因。该基因线路已经成功的应用于非免疫系统间充质干细胞,通过在靶细胞中表达穿透细胞的融合蛋白将抗癌前药物转化为细胞毒性药物进而杀伤癌细胞。

  第二类闭环电路通过可溶性生物标记物(如内源性代谢物(图2C))激活,表1罗列了在工程细胞中实现的闭环电路,其具体的传感器系统,以及它们的治疗应用。Rssger及其同事设计了一种工程细胞,能够感知肥胖模型小鼠体内的的脂肪酸水平,并产生一种抑制食欲的激素pramlintide。他们使用了由PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体)与TtgR(根皮素反应阻遏物)融合而成的嵌合细胞内传感器系统。该系统利用TtgR调节PPARα-TtgR融合蛋白与弱组成性启动子的结合,利用PPARα招募不同的内源性转录调节剂来控制基因表达。在缺乏脂肪酸的情况下,PPARα招募一种抑制复合物来抑制转基因表达。相反,高水平的脂肪酸会触发激活复合物的形成,启动下游基因表达,产生pramlintide。此闭环电路既可以通过脂肪酸水平调节转基因表达,也可以通过添加根皮素(TtgR的天然配体)引导抑制性PPARα-TtgR从合成启动子中解离,关闭整个闭环电路。

  此外,实验人员借助工程HEK293细胞来感知高水平葡萄糖,并通过产生治疗蛋白胰岛素来控制1型和2型糖尿病小鼠模型体内的血糖稳态。同时,有研究将表达电压门控钙通道蛋白(Cav1.3)与Cav1.3介导的钙内流联系起来构建葡萄糖响应的工程细胞。该工程细胞的控制系统是由两部分组成,分别是传感器Cav1.3蛋白,以及效应器合成启动子驱动转基因(即胰岛素和胰高血糖素)表达的合成单元,其中合成启动子包含了内源性转录因子(即NFAT)的结合位点。人工β细胞(AβCs)是另一种工程细胞,通过检测高水平的葡萄糖以及利用囊泡融合机制分泌胰岛素来模拟β细胞功能。高水平的葡萄糖在AβCs中引发酶氧化和质子外流,在细胞质中创造低pH环境。这种与高血糖相关的低pH值诱导含有预形成和储存胰岛素的内部小脂质体囊泡 (ISVs) 上的肽的空间脱屏蔽,这些肽与外部大囊泡 (OLVs) 上的肽形成盘曲结构,导致胰岛素从ISVs释放。除了可溶性代谢物外,研究人员还利用非免疫细胞开发了一种免疫模拟细胞,并证明它能够感知细菌感染并产生抗菌肽来治疗耐甲氧西林金葡萄球菌(MRSA)。免疫模拟定制细胞通过表达人Toll样受体,激活NF-κB内源性信号通路。这种内源性途径被重新连接到一个合成表达单元,以表达溶葡萄球菌酶(一种对金葡萄球菌高度致死的溶菌酶)。

  尽管定制细胞通常用于治疗各种疾病,但也有一些例子表明,定制细胞中的闭环遗传回路可用于早期诊断。在这种情况下,通过重新设计工程细胞的传感器系统以产生警报信号,而不是产生治疗性蛋白质。例如,“生物纹身”即通过改造细胞使其在感知到高钙血症(通常与癌症相关的早期标志物)时,产生黑色素。为了开发这种基于定制细胞的生物纹身,将钙敏感受体(CaSR)重新连接到一个合成表达单元,该合成表达单元在激活时产生酪氨酸酶。在自然条件中,酪氨酸酶是在黑素细胞中产生色素的特殊细胞器(黑素体)中产生的,它催化酪氨酸等酚类氧化形成黑色素,以保护身体免受有害的紫外线辐射。然而,在这类非黑素生成的定制细胞中,酪氨酸酶产生黑素是响应持续升高的血液Ca2+水平,以检测癌症的早期发生。

  图2. 闭环介导的治疗基因线路。(A) 细胞间物理接触介导的定制细胞。这种方法利用暴露在靶细胞表面的抗原(生物标记物)和细胞间的物理作用来激活定制细胞。SUPRA是一种通用型的CAR系统,能够使特异性的T细胞与不同的用户定义的抗原结合,并在激活时触发内源性信号通路。SynNotch依赖于细胞与细胞相互作用后的嵌合受体的切割。切割后的SynNotch的胞内结构域转运到到细胞核内并启动治疗基因的转录表达。另一种细胞接触传感器是基于CD43ex-45int的物理分离。在缺乏靶细胞的情况下,CD43ex-45int抑制JAK/STAT信号通路。一旦定制细胞与靶细胞结合,CD43ex-45int大的胞外域受到物理力的作用,使得CD43ex-45int从细胞相互作用的界面中分离出来。因此,JAK/STAT通路将被激活并启动治疗蛋白的表达。(B) 代谢产物介导的闭环系统。高水平的可溶性生物标记物可以刺激定制细胞产生治疗药物,使生物标记物的水平维持在正常范围。如在免疫模拟细胞中,TLR平台用于激活NFκB通路并表达抗菌肽(溶葡萄球菌素)来治疗MRSA。如β细胞模拟的定制细胞被用于感应血液中的葡萄糖浓度,并通过在HEK293细胞上重组到合成表达单元的Cav1.3上表达产生胰岛素原蛋白(胰岛素和hGLP1)。如监测癌症发生的定制细胞,通过感知血液中的钙浓度,在高钙生理条件下被激活表达酪氨酸酶,产生生物纹身。生物纹身是酪氨酸酶介导产生的黑色素。

  开环系统没有任何基因编码的负反馈环,但通常使用外源诱导物(如化合物或物理信号)来激活基因表达。化学诱导分子包括有机和无机化合物、刺激肽和挥发性气味剂等(图3A)。例如,Rivera及其同事通过改造哺乳动物细胞,使其在科研人员施用AP22542(一种可以结合FKBP12(FK506结合蛋白)化合物)的情况下能够快速分泌胰岛素。该策略依赖于编码包含FKBP多个重复序列调控域的表达,该结构物通过将包含furin裂解位点的连接物连接到胰岛素上。在缺乏AP22542的情况下,FKBP胰岛素融合蛋白聚集在内质网(ER)中,阻止向高尔基体的有效运输。反过来,AP22542的加入导致FKBP解离,从内质网释放融合蛋白,并转运到高尔基体。在反式高尔基体中,furin蛋白酶将胰岛素部分切断,然后分泌胰岛素。Rivera及其同事表明,在使用AP22542诱导2小时后,胰岛素得以分泌,这足以减轻1型糖尿病的疾病症状。除了无机化合物外,我们日常饮食中的可食用分子也可作为基因线路的触发剂。例如,通过引入C-STAR(咖啡因刺激的调控模块)而改造的工程细胞,可在饮用商用咖啡时产生一种临床许可的2型糖尿病治疗蛋白-胰高血糖素样肽1。C-STAR细胞借助咖啡因诱导嵌合受体二聚化,激活JAK-STAT3通路。该基因被重新连接到一个包含STAT3的结合位点合成表达单元,以驱动胰高血糖素样肽1的表达。这项研究表明,在植入C-STAR细胞的2型糖尿病小鼠中服用咖啡就可以实现小鼠血糖的稳态控制。气味也可以作为基因线路的诱导物,“Aroma cells”就是一种气味调控的定制化细胞用于缓解疼痛。这类气味调控的定制细胞组成型表达气味触发的嗅觉受体,该受体能在薄荷香味刺激后激活cAMP途径,cAMP信号分子的上调促使cAMP响应的合成启动子驱动下游治疗蛋白huwentoxin IV的表达,进而选择性地抑制疼痛介导的电压门控钠通道NaV1.7,以缓解疼痛。尽管化学诱导剂具有很高的诱导潜能和易用性,但其潜在的临床应用却常常受副作用、生物利用度或药效学的限制。化学诱导物存在自由扩散的特性,易扩散至身体其他非靶向部位,导致很难实现快速可控地“停止”细胞行为。

  相反,无痕迹物理诱导剂可以提供一种强劲、高效和精确的方法,在特定的时间和空间上控制细胞行为。基于物理诱导物的方法也降低了交叉反应和靶外效应的可能性,并且还避免了侵入组织或靶器官的需要。无痕诱导剂包括光、磁力和机械力、热和电刺激,可实现无创、安全、远程地控制工程细胞(图3B)。表2列出了远程可控定制细胞及其在转化医学中的应用。光遗传学是以光作为输入信号刺激工程化细胞内的遗传电路。光作为诱导剂具备高时空分辨率、优异的可调节性和易逆转性等优势。

  opto-HEK细胞是一种光控的定制哺乳动物细胞,包含光敏受体和合成启动子驱动表达目的蛋白的合成表达元件两部分。这些表达黑视蛋白(一种蓝光敏感的G蛋白藕联受体)的opto-HEK细胞,通过触发钙通道,使钙响应的合成启动子驱动表达胰高血糖素。当Optio-HEK细胞植入至2型糖尿病小鼠中,小鼠通过蓝光照射后血糖稳态得到了显著的控制。机械扰动是另一种无痕迹的物理方法,可通过机械敏感离子通道或受体介导。通过压缩和拉伸等机械方式可以产生声学介导的剪切效应。例如,机械敏感离子通道Piezo1的表达在低频超声刺激下触发T细胞的钙离子内流,从而远程且精确定时触发肿瘤部位的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的表达。磁遗传学还提供了一种基于外部磁场的远程程序调控的定制细胞。Stanley和他的同事开发了一种使用激活的磁性纳米颗粒刺激热敏离子通道(TRPV1)触发钙内流。他们利用无线 mT)磁场促使局部温度升高,刺激TRPV1通道触发钙内流,进而使合成钙反应表达单元启动胰岛素的表达释放。在热遗传学中,温度的变化可以用来刺激工程细胞。到目前为止,已经设计出可直接由低温(冷却、低温)或高温(加热、热疗)控制的工程细胞。例如,升高温度通常会引发细胞应激效应,激活相关转录因子,如热休克蛋白。使用包含热休克蛋白70B′的热启动子(HSPA6启动子),可在肿瘤部位使用热刺激的方式诱导T细胞活化。电遗传学是另一种利用电脉冲实现无痕迹编程设计细胞行为的技术。最近,通过异位表达电压门控通路(包括电压门控钙通道)开发了一种电控定制细胞(CaV1.2)。通过与内向整流钾通道(Kir 2.1)耦合,使这一遗传电路可以在电刺激时介导钙离子内流,由此产生的细胞溶质钙浓度升高触发合成表达单元的转基因表达。为了开发具有更快动力学的工程细胞,将类似的电压门控电路上载至胰腺β细胞系,称为electroβ细胞,能够在电刺激后20分钟内释放预先形成的胰岛素。在四氧嘧啶诱导的1型糖尿病小鼠模型中,electroβ细胞可快速释放胰岛素,实现血糖的稳态控制。

  图3. 开环介导的治疗基因线路。(A) 通过化学分子控制细胞行为。RAPID细胞被设计成在添加AP22542后从ER中释放预先形成的目标蛋白。编码治疗基因(胰岛素或生长因子)的结构体融合到一个修饰的FKBP中,并与一个弗林蛋白酶切位点隔开。这种结构在内质网中聚集,但在AP22542存在时可以单体化,并被运输到质膜上,快速释放被切割的治疗蛋白。Aroma细胞表达一个嗅觉受体,通过激活内源性cAMP途径感知挥发性薄荷并产生虎文毒素IV。C-STAR细胞是基于咖啡因诱导的嵌合体二聚化开发的。在2型糖尿病中,激活的受体通过JAK/STAT3途径表达hGLP1。(B) 物理因素调控的定制细胞。蓝光调控的定制细胞:opto-HEK细胞包含黑色素视蛋白受体,允许钙离子在蓝光照射下涌入,触发hGLP1的表达。磁控的定制细胞:采用磁热策略,利用磁性纳米颗粒刺激TRPV1通道,触发钙流入HEK细胞,使得胰岛素在无线 mT)刺激下表达。微波调控的定制细胞:T细胞上机械敏感的Piezo 1离子通道异位表达可在低频超声刺激下触发钙内流及相关下游转录因子(如NFAT)。该系统的实现是为了远程和精确地诱导肿瘤部位T细胞上的anti-CD19嵌合抗原受体(CARs)的表达。使用含有热休克蛋白结合位点的合成表达单元的T细胞进行高温刺激,可以无线诱导CAR在所需肿瘤位点的表达。电控的定制细胞:电刺激工程化的Electroβ 细胞表达电压门控钙通道(CaV1.2)与内整流钾通道(Kir2.1)耦合,使预先形成的胰岛素快速释放(电刺激后20分钟内)。

  利用工程细胞按需生产治疗药物用于疾病治疗正在超越概念性的验证,基于CAR-T的癌症治疗就是其先驱性的应用。随着分子生物学、材料科学和数字设备领域的发展,一些针对定制细胞的设计开发、制备和植入等涌现的新技术有望通过提高细胞治疗的安全性、有效性和特异性来迅速推进未来细胞疗法的发展。例如在分子生物学领域,现正在开发以最大的效率、最小的细胞毒性以及低风险的方法将生物元件递送到工程细胞中。虽然有很多可靠的方法将DNA递送至细胞中,但递送载量较大的基因线路(例如多组分基因线路)仍然是一个挑战。另外,快速发展的基因编辑领域和基于可编程蛋白酶的应用,如CRISPR/Cas9,使目标元件精准的整合至细胞基因组上成为可能。例如,将人工合成的基因线路整合到一个较安全的基因组位点上(如AAVS1),可以防止基因沉默,同时又保证插入基因长时间的存在。制备足够规模的工程细胞以满足临床需求是细胞治疗的另一个挑战。一般来说,相比于原代细胞或干细胞,人工细胞更适合通过生物反应器培养,因此更容易大规模的扩增。患者的免疫系统对移植细胞的激活也是一个主要问题。人源化的基因线路便可降低细胞移植后的免疫原性反应。因此,增加人源化基因线路在工程细胞中的使用会最大程度上降低免疫系统反应的风险。细胞封装是另一种使植入的细胞逃避免疫系统反应的策略。利用材料工程开发新的细胞封装策略可确保定制细胞的长期移植。另外,微型的生物兼容性材料在基于光遗传学和电遗传学的细胞治疗具有重要意义。与可穿戴的电子装备等数字化科技的结合也有助于个性化的细胞治疗。智能手机和智能手表等可穿戴的智能装置可以装载健康相关的生物传感器系统,也可以利用无线电和特殊的医学传感器相连接。因此,智能装置提供了一个可靠的传感器平台,作为接收器模块,感受生物标记物水平并将数据传送给病人,确保患者通过化学化合物或物理诱导物(如光)来调控治疗药物的水平。此外,电子装备可以潜在地收集每日健康相关数据,通过人工算法或机器学习模型对其进行分析。处理后的信息可以通过物联网和与健康相关的数据相结合,最终传输给临床医生,从而实现对患者状态的持续监测。另外,通过对定制细胞的设计,使其在特定的时间,按照需求释放治疗药物将有助于医生实现远程控制的治疗。

  总的来说,该综述介绍了哺乳动物细胞基因线路设计的主要原则参数,使细胞能感知自定义的配体,对其进行分析处理并产生定制化的响应。虽然细胞工程在疾病治疗中仍然存在挑战,但合成生物学领域正在迅速发展,早期检测和治疗性干预应用的进一步提升有望在不久的将来实现。